Ультрафильтрациялық центрифуга түтігін қолдану және сақтық шаралары
1) Сәйкес ультрафильтрация түтігін таңдаңыз.UF мембраналары әртүрлі химиялық заттарға төзімділік деңгейінде ерекшеленетінін ескеріңіз.Әдетте, 10 кДа молекулярлық массасы бар ультрафильтрациялық түтіктерді 35 кДа сияқты қызығушылық танытатын ақуыздың молекулалық салмағының 1/3 бөлігінен аспауы тиіс молекулалық салмақты шектеумен таңдауға болады.Егер қызығушылық танытатын ақуыздың молекулалық массасы 10 кд шамасында болса, молекулалық салмағы 3 КД кесіндісі бар ультрафильтрациялық түтік пайдалануға болады.
(2) Жаңадан сатып алынған ультрасүзгі құрғақ, пайдалану алдында ультра таза су қосылған және мембранадан, мұз ваннасынан немесе тоңазытқыштан толығымен өткен су бірнеше минутқа алдын ала салқындаған.Содан кейін су құйылады, яғни протеин сұйықтығы және түтіктің жоғарғы жағындағы ақ сызықтан аспайтын мөлшерде қанша қосылады.Операция жеңіл және ақуыз ерітіндісін қоспас бұрын ультрафильтрация түтігін мұзда алдын ала салқындату керек.
3) Массасы да, ауырлық центрі де тепе-теңдікке жетуі керек еді.Айналу жылдамдығы мен жеделдету өте жылдам емес екенін ескеріңіз, әйтпесе ультрафильтрациялық мембрана тікелей зақымдалады.Центрифугалық ультрафильтрация басталды (центрифуга 4 градусқа дейін алдын ала салқындатылған).Әртүрлі центрифугалардың айналу жылдамдығын g-ге айналдырғаннан кейін ол басқаша болды.Центрифуганың жылдамдауы мембранадағы қысымды төмендете отырып, минимумға дейін реттелді.Есіңізде болсын, центрифуга тағайындалған жылдамдығына жеткеннен кейін центрифуганы қалдыруды ұмытпаңыз немесе мәселе туындаса, оны бірінші рет өңдеу мүмкін емес.Мембрананың шпиндельге бағыты нұсқауларға сәйкес реттелді (бұрыштық центрифуга корпусы мембрана осіне перпендикуляр).Практикалық қолдануда жалпы айналу жылдамдығы нұсқаулықтағыдан төмен, сондықтан центрифуга түтігінің қызмет ету мерзімін ұзартуға болады.
3) Массасы да, ауырлық центрі де тепе-теңдікке жетуі керек еді.Айналу жылдамдығы мен жеделдету өте жылдам емес екенін ескеріңіз, әйтпесе ультрафильтрациялық мембрана тікелей зақымдалады.Центрифугалық ультрафильтрация басталды (центрифуга 4 градусқа дейін алдын ала салқындатылған).Әртүрлі центрифугалардың айналу жылдамдығын g-ге айналдырғаннан кейін ол басқаша болды.Центрифуганың жылдамдауы мембранадағы қысымды төмендете отырып, минимумға дейін реттелді.Есіңізде болсын, центрифуга тағайындалған жылдамдығына жеткеннен кейін центрифуганы қалдыруды ұмытпаңыз немесе мәселе туындаса, оны бірінші рет өңдеу мүмкін емес.Мембрананың шпиндельге бағыты нұсқауларға сәйкес реттелді (бұрыштық центрифуга корпусы мембрана осіне перпендикуляр).Практикалық қолдануда жалпы айналу жылдамдығы нұсқаулықтағыдан төмен, сондықтан центрифуга түтігінің қызмет ету мерзімін ұзартуға болады.
(4) Қалған 1мл-ге концентрацияланған кезде, 50ул буферлік ерітіндіні алыңыз, 10ул ағынды қосыңыз және ультрафильтрация түтігінде ақуыз жетіспейтінін анықтау үшін көк түстің бар-жоғын тексеріңіз.Түтік ағып кетсе, ультрасүзуді бастау үшін жоғарғы қабатты қайта құйып, жаңа түтікке ағызыңыз.Түтіктердің өткізіп алғанын дәл анықтау үшін, протеин желімінде немесе Брэдфорд шикі талдауында ағынды өткізу алдында 5 мгмл BSA ерітіндісімен 10 минут бойы центрифугалаңыз және қалған концентрленген ақуыз ерітіндісін (мұзда жұмыс істейтін және ақуыздардың қызуын болдырмайтын) қосу арқылы жалғастырыңыз. барлық концентрат қосылды.Центрифугалау кезінде протеиндердің тұнбаға түсуі, түтіктің жабылуына әкеліп соқтырса, сақ болыңыз.Егер жауын-шашын пайда болса, жауын-шашынның нақты себебі шамадан тыс ақуыз концентрациясы немесе сәйкес емес буфер екенін анықтаңыз;Біріншісін бір уақытта бірнеше ультрафильтрациялық түтіктерді ультрафильтрациялау, концентрацияны төмендету арқылы шешуге болады, ал екіншісін ақуыздың тұнбалары пайда болмайынша әртүрлі буферлік ерітінділермен алмасу арқылы шешуге болады.
(4) Қалған 1мл-ге концентрацияланған кезде, 50ул буферлік ерітіндіні алыңыз, 10ул ағынды қосыңыз және ультрафильтрация түтігінде ақуыз жетіспейтінін анықтау үшін көк түстің бар-жоғын тексеріңіз.Түтік ағып кетсе, ультрасүзуді бастау үшін жоғарғы қабатты қайта құйып, жаңа түтікке ағызыңыз.Түтіктердің өткізіп алғанын дәл анықтау үшін, протеин желімінде немесе Брэдфорд шикі талдауында ағынды өткізер алдында 5 мгмл BSA ерітіндісімен 10 минут бойы центрифугалаңыз және қалған концентрленген ақуыз ерітіндісін (мұзда жұмыс істейтін және ақуыздардың қызуын болдырмайтын) қосу арқылы жалғастырыңыз. барлық концентрат қосылды.Центрифугалау кезінде протеиндердің тұнбаға түсуі, түтіктің жабылуына әкеліп соқтырса, сақ болыңыз.Егер жауын-шашын пайда болса, жауын-шашынның нақты себебі шамадан тыс ақуыз концентрациясы немесе сәйкес емес буфер екенін анықтаңыз;Біріншісін бірнеше ультрафильтрациялық түтіктерді бір уақытта ультрафильтрациялау, концентрацияны төмендету арқылы шешуге болады, ал екіншісін ақуыздың тұнбалары пайда болмайынша әртүрлі буферлік ерітінділермен алмасу арқылы шешуге болады.
(5) Алғашқы бірнеше қадам ақуызды концентраттау үшін қолданылады және буферді өзгерту қажет болса, шамамен 1 мл жалпы ақуызға жаңа буферді (0,22 мм ультрафильтрациялық мембрана арқылы ультрафильтрация) ақырын қосыңыз және үш рет шамамен 1 мл-ге дейін қайта концентрациялаңыз. қажетті ақуыз концентрациясына байланысты соңғы концентрленген соңғы көлемімен, әдетте 500ул-ден көп емес, сонымен қатар 200ул шегінде қатарынан рет.Үш рет 1000 × немесе одан да көп мәнге қол жеткізіңіз, бұл әр жолы кемінде 10 × немесе одан да көп көлемді байыту арқылы есептелетіндей буфердің өзгеруі.
(5) Алғашқы бірнеше қадам ақуызды концентраттау үшін қолданылады және буферді өзгерту қажет болса, шамамен 1 мл жалпы ақуызға жаңа буферді (0,22 мм ультрафильтрациялық мембрана арқылы ультрафильтрация) ақырын қосыңыз және үш рет шамамен 1 мл-ге дейін қайта концентрациялаңыз. қажетті ақуыз концентрациясына байланысты соңғы концентрленген соңғы көлемімен, әдетте 500ул-ден көп емес, сонымен қатар 200ул шегінде қатарынан рет.Үш рет 1000 × немесе одан да көп мәнге қол жеткізіңіз, бұл әр жолы кемінде 10 × немесе одан да көп көлемді байыту арқылы есептелетіндей буфердің өзгеруі.
Жіберу уақыты: 09 қараша 2022 ж