ПТР, ДНҚ-полимераза катализінде жүйеге dNTP, Mg2+, ұзарту факторлары мен күшейтуді күшейту факторларының қосылуын білдіретін полимеразды тізбекті реакция, негізгі ДНҚ-ны үлгі ретінде және кеңейтудің бастапқы нүктесі ретінде арнайы праймерлерді пайдалана отырып, Денатурация, жасыту, ұзарту және т.б. қадамдары арқылы ДНҚ-ның ата-аналық тізбек үлгісін толықтыратын еншілес тізбекті in vitro репликациялау процесі in vitro кез келген мақсатты ДНҚ-ны тез және арнайы күшейте алады.
1. Ыстық бастау ПТР
Кәдімгі ПТР-де күшейтудің басталу уақыты ПТР аппаратын ПТР аппаратына салу емес, содан кейін бағдарлама күшейте бастайды.Жүйе конфигурациясы аяқталғаннан кейін күшейту басталады, бұл спецификалық емес күшейтуді тудыруы мүмкін және ыстық іске қосу ПТР бұл мәселені шеше алады.
Ыстық бастау ПТР дегеніміз не?Реакция жүйесі дайындалғаннан кейін фермент модификаторы реакцияның бастапқы қыздыру сатысында немесе «ыстық бастау» кезеңінде жоғары температурада (әдетте 90°C жоғары) шығарылады, осылайша ДНҚ полимераза белсендіріледі.Нақты белсендіру уақыты мен температурасы ДНҚ-полимеразаның және ыстық старт модификаторының табиғатына байланысты.Бұл әдіс негізінен ДНҚ-полимераза белсенділігін тежеу үшін антиденелер, аффинді лигандтар немесе химиялық модификаторлар сияқты модификаторларды пайдаланады.ДНҚ-полимеразаның белсенділігі бөлме температурасында тежелгендіктен, ыстық бастау технологиясы ПТР реакцияларының ерекшелігін жоғалтпай бөлме температурасында бірнеше ПТР реакция жүйелерін дайындауға үлкен ыңғайлылық береді.
2. RT-ПТР
RT-PCR (кері транскрипциялық ПТР) – мРНҚ-дан кДНҚ-ға кері транскрипциялау және оны күшейту үшін үлгі ретінде пайдалану үшін тәжірибелік әдіс.Эксперименттік процедура алдымен тіндерде немесе жасушаларда жалпы РНҚ бөліп алу, праймер ретінде Олиго (dT) пайдалану, cDNA синтездеу үшін кері транскриптазаны пайдалану, содан кейін мақсатты генді алу немесе ген экспрессиясын анықтау үшін ПТР күшейту үшін үлгі ретінде cDNA пайдалану болып табылады.
3. Флуоресцентті сандық ПТР
Флуоресцентті сандық ПТР (нақты уақыттағы сандық ПТР,RT-qPCR) нақты уақыт режимінде бүкіл ПТР процесін бақылау үшін флуоресцентті сигналдардың жинақталуын пайдаланып, ең соңында үлгіні сандық талдау үшін стандартты қисық сызығының көмегімен ПТР реакциясы жүйесіне флуоресцентті топтарды қосу әдісін білдіреді.Жиі қолданылатын qPCR әдістеріне SYBR Green I және TaqMan кіреді.
4. Кірістірілген ПТР
Кірістірілген ПТР ПТР күшейтудің екі айналымы үшін ПТР праймерлерінің екі жинағын пайдалануды білдіреді, ал екінші айналымның күшейту өнімі мақсатты ген фрагменті болып табылады.
Егер праймерлердің бірінші жұбының (сыртқы праймерлердің) сәйкес келмеуі спецификалық емес өнімді күшейтуге себеп болса, сол спецификалық емес аймақты праймерлердің екінші жұбымен тану және күшейтуді жалғастыру мүмкіндігі өте аз, сондықтан праймерлердің екінші жұбы арқылы күшейту, ПТР ерекшелігі жақсарды.ПТР-ның екі айналымын орындаудың бір артықшылығы - бұл шектеулі бастапқы ДНҚ-дан жеткілікті өнімді көбейтуге көмектеседі.
5. Сенсорлық ПТР
Touchdown ПТР – ПТР циклінің параметрлерін реттеу арқылы ПТР реакциясының ерекшелігін жақсарту әдісі.
ПТР-да алғашқы бірнеше цикл үшін жасыту температурасы праймерлердің максималды жасыту температурасынан (Tm) бірнеше градусқа жоғары орнатылады.Жасыту температурасының жоғарылауы спецификалық емес күшейтуді тиімді төмендетуі мүмкін, бірақ сонымен бірге жоғары жасыту температурасы праймерлердің және мақсатты тізбектердің бөлінуін нашарлатады, нәтижесінде ПТР шығымы төмендейді.Сондықтан, алғашқы бірнеше циклдерде жүйедегі мақсатты геннің мазмұнын арттыру үшін жасыту температурасы әдетте цикл сайын 1°C төмендейді.Жасыту температурасы оңтайлы температураға дейін төмендетілгенде, жасыту температурасы қалған циклдар үшін сақталады.
6. Тікелей ПТР
Тікелей ПТР мақсатты ДНҚ-ны нуклеин қышқылын оқшаулау мен тазартуды қажет етпей, үлгіден тікелей күшейтуді білдіреді.
Тікелей ПТР екі түрі бар:
тікелей әдіс: сынаманың аз мөлшерін алыңыз және оны ПТР идентификациясы үшін тікелей ПТР Мастер Миксіне қосыңыз;
крекинг әдісі: үлгіні іріктеп алғаннан кейін оны лизатқа қосыңыз, геномды босату үшін лиздендіріңіз, лизденген үстіңгі заттың аз мөлшерін алыңыз және оны ПТР мастер-миксіне қосыңыз, ПТР идентификациясын орындаңыз.Бұл тәсіл тәжірибелік жұмыс процесін жеңілдетеді, практикалық жұмыс уақытын қысқартады және тазарту қадамдары кезінде ДНҚ жоғалуын болдырмайды.
7. SOE ПТР
Қабаттасу ұзартуымен генді қосу ПТР (SOE ПТР) ПТР өнімдерін қабаттасатын тізбектер жасау үшін қосымша ұштары бар праймерлерді пайдаланады, осылайша келесі күшейту реакциясында қабаттасатын тізбектерді ұзарту арқылы күшейтілген фрагменттердің қабаттасатын A техникасының әртүрлі көздері және біріктірілген.Бұл технологияның қазіргі уақытта екі негізгі қолдану бағыты бар: синтез гендерінің құрылысы;гендік сайтқа бағытталған мутация.
8. IPCR
Кері ПТР (IPCR) екі праймерден басқа ДНҚ фрагменттерін күшейту үшін кері комплементарлы праймерлерді пайдаланады және белгілі ДНҚ фрагментінің екі жағындағы белгісіз тізбектерді күшейтеді.
IPCR бастапқыда іргелес белгісіз аймақтардың тізбегін анықтауға арналған және көбінесе гендік промоторлар ретін зерттеу үшін қолданылады;гендердің синтезі, транслокациясы және транспозициясы сияқты онкогенді хромосомалық қайта құрулар;және вирустық гендердің интеграциясы, сондай-ақ қазір жиі пайдаланылады.
9. dPCR
Сандық ПТР (dPCR) - нуклеин қышқылы молекулаларының абсолютті сандық анықтау әдісі.
Қазіргі уақытта нуклеин қышқылының молекулаларын сандық анықтаудың үш әдісі бар.Фотометрия нуклеин қышқылы молекулаларының сіңірілуіне негізделген;нақты уақыттағы флуоресценттік сандық ПТР (Real Time PCR) Ct мәніне негізделген, ал Ct мәні анықтауға болатын флуоресценция мәніне сәйкес цикл нөмірін білдіреді;сандық ПТР – нуклеин қышқылын санауға арналған бір молекулалы ПТР әдісіне негізделген ең соңғы Сандық технология.
Хабарлама уақыты: 13 маусым 2023 ж